Кратка дискусия върху химическия синтез на олигонуклеотидни лекарства и фосфорни реагенти-CTPPA

(Фосфорни реагенти-CTPPA:2-цианоетил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфородиамидит CAS №:102691-36-1)

Областта на лекарствата на нуклеинова киселина привлече значително внимание през последните години. Одобрението и пускането на пазара на лекарства с нуклеинова киселина се ускориха и редица такива лекарства с потенциал да се превърнат в хитови продукти пуснаха клинични данни, обхващащи области като сърдечно-съдови и метаболитни заболявания, чернодробни заболявания и различни редки заболявания. Към първата половина на 2025 г. общо 22 малки лекарства с нуклеинова киселина (включително тези, които вече са изтеглени от пазара) са одобрени за глобален маркетинг, състоящи се от 13 ASO лекарства, 7 siRNA лекарства и 2 лиганд-базирани лекарства.

По отношение на класификацията най-голям дял заемат АСО лекарствата, като 13 пуснати на пазара лекарства представляват 59,09% от общия брой. Това е последвано от siRNA лекарства, като 7 пуснати на пазара лекарства съставляват 31,81%. От гледна точка на показанията, 17 лекарства са насочени към редки генетични заболявания, 3 са насочени към офталмологични заболявания, 1 е насочен към сърдечно-съдови заболявания и 1 е насочен към хематологични онкологични усложнения. Разпределението на показанията представя модел на „редки заболявания като основен фокус, с пробиви в множество области“. Очевидно е, че клиничното приложение на лекарства с малки нуклеинови киселини постепенно се разширява отвъд сферата на редките болести към други болестни области.

С нарастващите изследвания върху лекарствата от нуклеинови киселини широкомащабното-производство на различни олигонуклеотидни лекарства постепенно ще се превърне в бъдеща тенденция, сред които химическият синтез е основният метод за синтезиране на късоверижни-олигонуклеотиди. След като са претърпели повече от половин век развитие, методите за химичен синтез на олигонуклеотиди са еволюирали от първоначалния фосфодиестерен метод до фосфотриестерния метод и фосфитния метод, а след това до понастоящем зрелия фосфорамидитен метод. Подобно на пептидния синтез, олигонуклеотидният синтез може също да бъде разделен на синтез в разтвор-фаза и синтез в твърда-фаза от друга гледна точка. Тази статия представя най-често използваните "фосфорни реагенти" и техните приложения в синтеза на нуклеозидни мономери.

Фигура 1 Фосфитилиращи реагенти и активиращи реагенти

При синтеза на олигонуклеотиди, получаването на нуклеозидни мономери е незаменима стъпка. Понастоящем има два основни фосфитилиращи реагента, широко използвани за синтезиране на различни нуклеозидни мономери: единият е 2-цианоетил N,N-диизопропилхлорофосфорамидит (1) [1]; другият е бис(диизопропиламино)(2-цианоетокси)фосфин (2) (Фигура 1) [2]. 2-цианоетил N,N-диизопропилхлорофосфорамидит (1) проявява най-висока реактивност и лесно кондензира с алкохоли. Обратно, бис(диизопропиламино)(2-цианоетокси)фосфин (2) изисква in situ активиране, катализирано от слабо киселинни реагенти като тетразол, преди да може да претърпи кондензация с алкохоли (Фигура 1). От практическа гледна точка 2-цианоетил N,N-диизопропилхлорофосфорамидит (1) е по-скъп от бис(диизопропиламино)(2-цианоетокси)фосфин (2). Поради високата си реактивност, 2-цианоетил N,N-диизопропилхлорофосфорамидит (1) е по-податлив на разграждане, което прави употребата и съхранението му неудобни. Той също има тенденция да въвежда допълнителни примеси по време на реакцията, което води до по-малко идеална чистота и добив. Следователно бис(диизопропиламино)(2-цианоетокси)фосфин (2) в момента е по-често използваният фосфитилиращ реагент при получаването на нуклеозидни мономери и често се съкращава като "фосфорен реагент".

Фигура 2 Реакционен механизъм на тетразол-катализирано фосфитилиране

В процеса на кондензация между „фосфорни реагенти“ и алкохоли обикновено се добавя стехиометрично или под{0}}стехиометрично количество от активиращ реагент. Най-често използваните активиращи реагенти включват тетразол, 4,5-дицианоимидазол и пиридиниев трифлуороацетат [3,4]. Понастоящем механизмът на реакцията на кондензация между "фосфорни реагенти" и алкохоли, катализирани от тетразол, е подробно проучен [5-7].

Реакцията протича по следния начин: първо, "фосфорният реагент" претърпява протониране; след това диизопропиламинът се замества с тетразол; впоследствие тетразолът се заменя с алкохол (Фигура 2). Сред тези стъпки, заместването на диизопропиламин с тетразол е скоростта-определяща стъпка.

Сред трите гореспоменати активиращи реагента, тетразолът има най-силна киселинност (pKa=4.89) [3], която е сравнима с тази на оцетната киселина (pKa=4.74). Обратно, 4,5-дицианоимидазол (pKa=5.20) [3] и пиридиниев трифлуороацетат (pKa=5.23) ​​[3] показват по-слаба киселинност.

Тъй като 5'-хидроксилната група в нуклеозидните мономери обикновено е защитена от киселинно-лабилната 4,4'-диметокситритил (DMT) група, използването на тетразол може да бъде придружено от странична реакция на премахване на защитата на DMT. Следователно 4,5-дицианоимидазол (pKa=5.20) и пиридиниев трифлуороацетат (pKa=5.23) понякога са по-идеален избор.

В допълнение, Koch et al. съобщават, че когато 4,5-дицианоимидазол се използва като активиращ реагент, може да се постигне пълно превръщане само с 0,7 еквивалента от реагента. Обратно, използването на повече от 1 еквивалент е предразположено към образуването на димерни странични продукти [4].

Свойства на „Фосфорен реагент-CTPPA“

"Фосфорен реагент" е безцветна или бледожълта течност с относително висока точка на кипене (115 градуса /0,6 Torr). Той е чувствителен както към кислород, така и към влага и има тенденция да се разгражда лесно по време на вакуумна дестилация, което прави широкомащабното -производство на този продукт предизвикателство. Междувременно, поради специалните си свойства, проверката на качеството на фосфорния реагент също създава значителни трудности. За потребителите, след всяка употреба, реагентът трябва да се защити с азот и да се съхранява в ексикатор. Тази практика може да удължи експлоатационния живот на реагента.

Нашата компания се занимава с научноизследователска и развойна дейност и производство на фосфорен реагент от близо десетилетие, натрупвайки богат опит в производството и тестването на продукта. Понастоящем можем да доставяме „фосфорен реагент“ с висока-чистота в килограмов мащаб. Освен това предлагаме и свързани продукти като тетразол и 4,5-дицианоимидазол. Приветстваме приятели със съответните нужди да се свържат с нас (Таблица 1).

Таблица 1 Съответни продукти, произведени и продадени от нашата компания

Референции

[1] Синха, Северна Дакота; McManus, J.; Köster, H. Nucleic Acids Research 1984, 12, 4539.

[2] Nielsen, J.; Taagaard, M.; Marugg, JE, et al. Nucleic Acids Research 1986, 14, 7391.

[3] Sanghvi, YS; Guo, Z.; Pfundheller, HM, et al. Organic Process Research Development 2000, 4, 175.

[4] Педерсен DS; Rosenbohm C.; Кох Т. Синтез 2002, 802.

[5] Nurminen, EJ; Mattinen, JK; Lönnberg, H. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998, 162.

[6] Бернер, С.; Mühlegger, K.; Seliger, H. Nucleic Acids Research 1989, 17, 853.

[7] Dahl, BM; Nielsen, J.; Dahl, O. Nucleic Acids Research 1987, 15, 1729.